2025年9月，來自京都大學(xué)醫(yī)學(xué)研究生院皮膚科等多個(gè)機(jī)構(gòu)的Naomi Kitayama研究團(tuán)隊(duì)，在《Biochemical and Biophysical Research Communications》期刊上發(fā)表了題為“Targeting PAR-2 in atopic dermatitis: Preclinical evaluation of the novel inhibitor E6795"的研究。該研究聚焦于特應(yīng)性皮炎（AD）的病理機(jī)制，對(duì)新型蛋白酶激活受體2（PAR-2）小分子抑制劑E6795進(jìn)行了臨床前評(píng)估，探究其在改善AD相關(guān)炎癥、瘙癢及皮膚屏障功能障礙等方面的作用。

摘要

特應(yīng)性皮炎（AD）是一種慢性炎癥性皮膚病，以濕疹樣皮損、劇烈瘙癢和皮膚屏障功能受損為特征。盡管新型治療方法不斷涌現(xiàn)，但許多患者仍面臨疾病控制不足、治療成本高及病情復(fù)發(fā)等問題。蛋白酶激活受體2（PAR-2）在AD皮損中過度表達(dá)，在促進(jìn)炎癥反應(yīng)、瘙癢感產(chǎn)生及表皮穩(wěn)態(tài)失衡中發(fā)揮作用。本研究提供了E6795的臨床前研究證據(jù)，該化合物是一種專為靶向上述病理過程設(shè)計(jì)的小分子PAR-2抑制劑。激酶和藥理學(xué)分析證實(shí)，E6795可選擇性抑制PAR-2，在廣泛的激酶和藥理學(xué)檢測(cè)面板中顯示出極低的脫靶相互作用。此外，E6795在兩種小鼠模型中均改善了AD相關(guān)終點(diǎn)指標(biāo)，包括減輕炎癥反應(yīng)和免疫細(xì)胞浸潤；口服給藥降低了經(jīng)表皮水分流失（TEWL），而2%局部乳膏制劑改善了與屏障功能相關(guān)的組織學(xué)表現(xiàn)及瘙癢癥狀。組織學(xué)檢查證實(shí)，E6795治療后炎癥細(xì)胞浸潤減少，皮膚屏障功能增強(qiáng)。研究結(jié)果表明，E6795通過選擇性抑制PAR-2信號(hào)傳導(dǎo)，靶向作用于AD病理生理學(xué)的三大支柱——屏障功能障礙、炎癥反應(yīng)和瘙癢。本研究強(qiáng)調(diào)了E6795作為一種具成本效益的新型AD局部治療藥物的潛力。

實(shí)驗(yàn)材料與儀器

（一）實(shí)驗(yàn)材料

1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：11-12周齡雄性Nc/Nga小鼠、6-14周齡雌性BALB/c小鼠、6-10周齡雄性C57BL/6J小鼠。

2. 試劑與抗體：MC903、E6795、PAR-2激動(dòng)肽SLIGKV-NH?和SLIGRL-NH?、胰蛋白酶、凝血酶、羧甲基纖維素、二甲基亞砜、烏拉坦、各種熒光標(biāo)記抗體、FLIPR鈣測(cè)定試劑、膠原酶II型、DNase I、10%福爾馬林、蘇木精-伊紅染色試劑、甲苯胺藍(lán)染色試劑等。

3. 細(xì)胞與組織樣本：人胚腎HEK293細(xì)胞、健康人皮膚樣本、AD患者皮損皮膚樣本。

（二）實(shí)驗(yàn)儀器

FDSS6000熒光檢測(cè)系統(tǒng)、FACS Fortessa流式細(xì)胞儀、FlowJo軟件、厚度計(jì)、劃痕測(cè)量系統(tǒng)、384孔聚丙烯試劑儲(chǔ)液板、I型膠原包被透明底黑色384孔板、通風(fēng)籠、顯微鏡及圖像分析系統(tǒng)、ASCH VAPOSCAN經(jīng)皮水分流失測(cè)量儀

ASCH VAPOSCAN經(jīng)皮水分流失測(cè)量儀

實(shí)驗(yàn)過程

1. 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：HEK293細(xì)胞在含3%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，接種于384孔板后負(fù)載FLIPR鈣測(cè)定試劑，加入不同濃度E6795預(yù)處理30分鐘，再加入胰蛋白酶或凝血酶，通過FDSS6000系統(tǒng)監(jiān)測(cè)120秒內(nèi)的實(shí)時(shí)熒光強(qiáng)度，采用四參數(shù)logistic模型計(jì)算IC??值。

2. 動(dòng)物模型構(gòu)建與給藥：

? MC903誘導(dǎo)AD模型：BALB/c小鼠耳部連續(xù)8天局部涂抹MC903，從第4天起，每日口服含E6795的羧甲基纖維素混懸液，對(duì)照組給予相應(yīng)溶媒。

? Nc/Nga嚴(yán)重AD模型：將患有皮炎的Nc/Nga小鼠分為5組，每日局部涂抹 E6795乳膏，持續(xù)7天，設(shè)未處理組作為生物學(xué)對(duì)照。

3. 藥效學(xué)評(píng)估：

皮膚屏障功能：通過ASCH VAPOSCAN經(jīng)皮水分流失測(cè)量儀測(cè)量第0、3、7天的經(jīng)表皮水分流失值（TEWL）；使用厚度計(jì)每日測(cè)量小鼠耳厚度。

ASCH VAPOSCAN經(jīng)皮水分流失測(cè)量儀

（c）第 3 天和第 7 天的經(jīng)表皮失水量（TEWL）檢測(cè)結(jié)果。與溶媒對(duì)照組相比，E6795 口服給藥在第 7 天可明顯降低 TEWL。數(shù)據(jù)以均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤表示（除第 8 天口服給藥組 n=3 外，其余各組 n=4）。* 校正后 P < 0.05，與溶媒對(duì)照組相比（鄧尼特檢驗(yàn)）

? 瘙癢行為檢測(cè)：在第7天17:00至次日07:00，將小鼠單獨(dú)置于測(cè)量籠中，經(jīng)2小時(shí)適應(yīng)期后，通過劃痕測(cè)量系統(tǒng)記錄12小時(shí)內(nèi)的搔抓行為頻率。

? 組織學(xué)與免疫組化分析：實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)收集小鼠耳部皮膚組織，經(jīng)甲醛固定、石蠟包埋后制作5μm切片，進(jìn)行H&E染色（觀察炎癥細(xì)胞浸潤和表皮厚度）、甲苯胺藍(lán)染色（計(jì)數(shù)肥大細(xì)胞）及PAR-2免疫組化染色；人皮膚樣本同樣進(jìn)行PAR-2免疫組化檢測(cè)。

? 流式細(xì)胞術(shù)分析：小鼠耳部皮膚組織經(jīng)酶解制備單細(xì)胞懸液，用熒光標(biāo)記抗體染色后，通過FACS Fortessa檢測(cè)嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、CD4?T細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞亞群的浸潤情況，結(jié)果以每平方毫米耳皮膚的絕對(duì)細(xì)胞數(shù)表示。

4. 藥代動(dòng)力學(xué)研究：檢測(cè)小鼠體內(nèi)E6795的血漿游離分?jǐn)?shù)、全血游離分?jǐn)?shù)及血-漿比，評(píng)估其全身吸收和分布特征。

5. 選擇性分析：通過激酶選擇性面板和CEREP藥理學(xué)結(jié)合面板，檢測(cè)1μM和10μM濃度下E6795對(duì)多種激酶、受體、離子通道的抑制作用，評(píng)估其脫靶活性。

6. 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：使用GraphPad Prism 7.03軟件，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）結(jié)合Dunnett多重比較檢驗(yàn)，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示。

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

1. E6795具有強(qiáng)效且選擇性的PAR-2抑制活性，細(xì)胞鈣通量測(cè)定中其IC??值為6.56nM，對(duì)PAR-1無抑制作用，且在廣泛的激酶和藥理學(xué)面板中脫靶活性極低。

2. 藥代動(dòng)力學(xué)顯示E6795口服可吸收，雖血漿蛋白結(jié)合率高達(dá)97.5%，但少量游離藥物即可發(fā)揮治療作用。

3. 免疫組化證實(shí)AD患者角質(zhì)形成細(xì)胞中PAR-2表達(dá)較健康人升高。

4. 在MC903誘導(dǎo)的AD小鼠模型中，E6795口服和局部給藥均能減少嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，口服給藥可降低TEWL、改善皮膚屏障功能，局部給藥能減輕耳厚度。

5. 在Nc/Nga AD小鼠模型中，2% E6795乳膏可減少表皮厚度、肥大細(xì)胞浸潤及搔抓行為，改善皮炎相關(guān)組織學(xué)表現(xiàn)。

6. E6795通過選擇性抑制PAR-2信號(hào)，靶向AD病理生理學(xué)的三大核心（炎癥、瘙癢、屏障功能障礙），具有作為成本效益高、微創(chuàng)局部治療藥物的潛力。

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