2025年1月23日，神戶學院大學的Ken-ichi Mizutani研究團隊在期刊《Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry》上發表了一篇題為“Rosae multiflorae fructus extracts regulate the differentiation and vascular endothelial cell-mediated proliferation of keratinocytes"的論文。研究聚焦野薔薇果提取物對角質形成細胞的調控作用，深入探究其對表皮分化、屏障功能、血管內皮細胞介導的增殖及傷口愈合的影響，同時鑒定了發揮作用的關鍵活性成分及相關分子機制。

摘要

角質形成細胞是表皮的主要組成成分，維持其增殖與分化的精確平衡對于保護表皮結構和功能至關重要。野薔薇果提取物在化妝品行業應用廣泛，但其一角質形成細胞有益作用的分子機制尚未明確。本研究發現，RMFE可促進體外培養的人正常表皮角質形成細胞和三維表皮模型的表皮分化，增強其屏障功能。此外，RMFE能促進人臍靜脈內皮細胞的增殖和血管生成，而經RMFE處理的HUVEC條件培養基可進一步促進NHEK增殖并提升其傷口愈合能力。成分活性分析表明，槲皮素衍生物可能是介導NHEK和HUVEC對RMFE產生應答的關鍵物質。綜上，這些結果提示RMFE通過直接作用于角質形成細胞和內皮細胞介導的間接作用，共同增強表皮功能。

實驗材料與儀器

材料

1. 野薔薇果提取物、化學化合物（異槲皮苷IQ、槲皮素3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷Q3GA、槲皮素3-O-β-D-半乳糖苷Q3Gal、鞣花酸EA、鞣花酸4-O-β-D-木糖苷EADX、鞣花酸4-O-α-L-阿拉伯呋喃糖苷EALA、仙鶴草素AM等）、鈣離子檢測試劑盒、細胞增殖檢測試劑盒、細胞毒性檢測試劑、凋亡與死細胞檢測試劑盒、BrdU、Mitomycin C。

2. 細胞系：人正常表皮角質形成細胞、人臍靜脈內皮細胞、人正常真皮成纖維細胞

3. 培養基及添加物：KGM-Gold培養基及添加因子試劑盒、EGM-2培養基及添加因子試劑盒、FGM-2培養基及添加因子試劑盒。

4. 細胞模型：三維皮膚表皮培養模型

5. 抗體：抗TJP1一抗、抗LOR一抗、抗OCLN一抗、抗CLDN1一抗、Alexa Fluor 488標記驢抗兔IgG二抗、Alexa Fluor 594標記驢抗小鼠IgG二抗、抗BrdU單克隆抗體。

6. 其他：Matrigel、硅膠柱、DAPI染色液。

儀器

CO?培養箱、離心機、濾膜、酶標儀、細胞分析儀、實時熒光定量PCR儀、共聚焦顯微鏡、跨上皮電阻儀、ASCH VAPOSCAN 經皮水分流失測量儀、相差顯微鏡、全功能熒光顯微鏡、液相色譜-飛行時間質譜儀、熱板、ImageJ圖像分析軟件、Adobe Photoshop圖像處理軟件、Microsoft Excel。

ASCH VAPOSCAN 經皮水分流失測量儀

實驗過程

1. 試劑制備與細胞培養：RMFE凍干粉溶解于實驗緩沖液或培養基中，使用多個批號提取物驗證效果一致性；NHEK、HUVEC、NHDF分別在對應培養基中于37℃、5%CO?條件下培養，培養基每2天更換一次，NHEK采用3名供體混合樣本以避免個體差異。

2. 條件培養基制備：P4代HUVEC或NHDF培養至50%-60%匯合度，經RMFE處理24小時后更換為KGM-Gold培養基繼續培養24小時，收集培養基，離心去除細胞碎片并過濾，制備內皮細胞條件培養基或成纖維細胞條件培養基，以無細胞培養的KGM-Gold培養基為對照。

3. 三維皮膚表皮模型培養：將RMFE應用于LabCyte EPI-MODEL24 6D模型的角質層側，在37℃、5%CO?條件下培養2或7天，每日更換含或不含RMFE的培養基。

4. 細胞增殖檢測：細胞接種于96孔板培養24小時后，經RMFE或目標化合物處理24小時，采用Cell Counting Kit-8檢測，測定450 nm處吸光度值并計算平均吸光度。

5. 細胞毒性與死細胞檢測：NHEK接種后經不同濃度RMFE處理，采用WST-1試劑檢測細胞毒性，通過Muse Annexin V & Dead Cell Kit結合Guava Muse Cell Analyzer檢測凋亡及死細胞比例。

6. RT-qPCR檢測：提取細胞總RNA并合成cDNA，采用SYBR Green標記進行定量PCR，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶為內參基因，分析分化標志物、屏障功能相關基因、表皮干細胞標志物及血管生成相關基因的表達水平。

7. 免疫熒光染色與成像：細胞或三維模型經4%多聚甲醛固定、封閉液處理后，加入一抗孵育過夜，再與熒光二抗孵育，DAPI染色細胞核，通過共聚焦顯微鏡獲取圖像；采用BrdU摻入法結合免疫熒光染色評估細胞增殖。

8. 屏障功能檢測：三維模型經RMFE處理2天后，使用跨上皮電阻儀檢測TEER值，計算單位面積電阻；通過ASCH VAPOSCAN 經皮水分流失測量儀檢測TEWL值，模型先在37℃熱板上放置30分鐘后再進行測量。

對照組和0.25 μ RMFE 處理的三維培養人表皮模型的跨表皮水分流失(TEWL)值      

9. 管形成實驗：48孔板包被Matrigel并孵育，接種P4代HUVEC并加入含RMFE的培養基，培養6小時后通過相差顯微鏡獲取圖像，ImageJ軟件分析管長、分支點數量及連接點數量。

10. 劃痕實驗：NHEK接種形成單層細胞后，用微量移液器吸頭劃痕，更換為含RMFE、對照ECCM或RMFE-ECCM的培養基，部分組添加Mitomycin C抑制增殖，培養48小時并進行時間序列成像，計算傷口閉合率。

11. LC-TOF/MS分析：采用液相色譜-飛行時間質譜儀分析RMFE成分，鑒定其含有的化學化合物。

12. 統計分析：兩組數據采用非配對雙側Student's t檢驗分析差異，結果以平均值±標準誤（SEM）表示，P<0.05、P<0.01、P<0.001分別表示不同水平。

實驗結論

1. RMFE可直接促進NHEK和三維表皮模型的表皮分化，上調早期分化標志物（K10、SPRR1B）和晚期分化標志物（兜甲蛋白、LOR）的表達，且K10表達呈劑量依賴性增加；同時上調緊密連接相關基因（OCLN、CLDN1、TJP1）及蛋白表達，增強TEER值并降低TEWL值，提升表皮屏障功能，該作用并非由鈣離子介導。

2. RMFE能促進HUVEC增殖和血管生成，RMFE-ECCM可促進NHEK增殖、上調表皮干細胞標志物（K15、DLL1）表達，且提升NHEK傷口愈合能力，該愈合作用依賴細胞增殖而非遷移；而RMFE-DFCM對NHEK無明顯影響，表明RMFE的作用更依賴內皮細胞介導。

3. LC-TOF/MS鑒定顯示，本研究使用的RMFE為II型（不含多花苷A），包含槲皮素衍生物（IQ、Q3GA、Q3Gal）、鞣花酸及其衍生物（EADX、EALA、AM、EA）等成分。

4. 槲皮素衍生物（尤其是IQ）是RMFE發揮作用的關鍵活性成分，可直接促進NHEK分化和屏障功能形成，降低TEWL值，同時促進HUVEC增殖并上調血管生成相關基因（內皮粘蛋白、DLL4、Apelin）表達。

5. 綜上，RMFE通過直接作用于角質形成細胞和內皮細胞介導的間接作用，雙重調控表皮增殖與分化平衡，增強表皮屏障功能并促進傷口愈合，為其在化妝品和醫藥領域的應用提供了分子機制支持。

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