2024年3月京都大學醫學院的中嶋千紗團隊在《Journal of Allergy and Clinical Immunology》（IF:14.2）上發表了題為“TRPV1-positive sensory nerves and neuropeptides are involved in epidermal barrier repair after tape stripping in mice"的研究文獻。研究以小鼠為實驗模型，探究了感覺神經在膠帶剝離誘導的表皮損傷后皮膚屏障修復中的具體作用，明確了TRPV1陽性感覺神經及相關神經肽在這一過程中的調控機制，同時揭示了生長抑素對白細胞介素6（IL-6）誘導的角質形成細胞分化下調的保護作用。

摘要

皮膚的表皮系統是一道重要的保護屏障，角質層處于這道屏障的最外層，由能生物合成絲聚蛋白的角質形成細胞構成，絲聚蛋白是維持皮膚健康的關鍵成分。然而，與傷口愈合過程不同，感覺神經在膠帶剝離誘導的表皮損傷后皮膚屏障修復中的具體作用，至今仍是一個未解之謎。

本研究旨在闡明感覺神經在膠帶剝離誘導的表皮損傷后表皮屏障修復中的潛在作用。研究人員通過構建樹脂毒素（RTX）處理的去神經小鼠模型，探究了膠帶剝離后小鼠皮膚屏障修復的動力學特征，并對小鼠皮膚或背根神經節進行免疫表型分析和基因表達分析，以篩選潛在的相關神經肽；同時評估了候選神經肽對小鼠角質形成細胞及RTX處理小鼠皮膚屏障恢復的功能影響。

結果顯示，消融TRPV1陽性感覺神經會減緩小鼠皮膚屏障的修復進程，并導致皮下炎癥持續存在，同時膠帶剝離后小鼠耳組織勻漿中的IL-6水平明顯升高；與對照組小鼠相比，RTX處理的小鼠耳皮膚中角質形成細胞分化標志物Flg的表達降低。經神經肽篩選發現，生長抑素或奧曲肽可逆轉IL-6介導的Flg表達下調；此外，給予奧曲肽的RTX處理小鼠，其膠帶剝離后的皮膚屏障修復得到部分改善。

研究結論為，表達TRPV1的感覺神經元在表皮損傷后的屏障功能恢復中發揮著重要的作用，本研究結果提示生長抑素可能參與了皮膚損傷后的表皮修復過程。

實驗材料與儀器列舉

實驗動物

4-12周齡雌性C57BL/6J小鼠、6-19周齡雌雄不限的Nav1.8-Cre R26-CAG-LoxP-EGFP-TeNT小鼠；Nav1.8-Cre小鼠、R26 CAG-LF-EGFP-TeNT小鼠、ACTB-FLPe小鼠。

實驗試劑

辣椒素、樹脂毒素、奧曲肽醋酸鹽、垂體腺苷酸環化酶激活多肽、甘丙肽、生長抑素、dispase II、0.05%胰蛋白酶-EDTA、角質形成細胞生長培養基2、溴脫氧尿苷、白細胞介素6、1.3 mM氯化鈣、TRIzol試劑、RNeasy Mini試劑盒、Prime Script RT反轉錄試劑盒、SYBR Green I Master、Bio-Plex細胞裂解試劑盒、Micro BCA蛋白測定試劑盒。

實驗儀器

ASCH VAPOSCAN經皮水分流失測量儀、pH計、LightCycler 480 Instrument II熒光定量PCR儀、FastPrep-24組織勻漿系統、Bio-Plex細胞因子檢測平臺、增殖酶聯免疫吸附測定試劑盒檢測相關設備、膠原包被的96孔板、24孔板、超低溫冰箱。

ASCH VAPOSCAN經皮水分流失測量儀

實驗過程

本研究整體圍繞動物模型構建、皮膚屏障損傷造模、分子檢測、細胞實驗四大核心環節展開，具體實驗步驟如下：

1. TRPV1陽性感覺神經去神經小鼠模型構建：對小鼠背部皮下注射梯度劑量的RTX（30、70、100 mg/kg），連續注射3天，對照組小鼠注射溶媒（含0.01%乙醇的PBS）；造模后讓小鼠休息至少3周，通過辣椒素誘導的眼部擦拭實驗驗證去神經效果，若小鼠無傷害性擦拭行為，表明TRPV1陽性感覺神經消融成功。

2. 膠帶剝離誘導小鼠皮膚表皮屏障損傷：使用Nichiban玻璃紙膠帶對小鼠左耳腹側進行連續膠帶剝離，直至經皮水分流失（TEWL）值達到60.0~90.0 g/m2·h；對于奧曲肽治療組，在膠帶剝離后立即對RTX處理小鼠皮下注射奧曲肽（100 mg/kg，每日兩次），持續5天，對照組注射PBS。

3. 皮膚屏障功能指標檢測：在膠帶剝離后的不同時間點，檢測小鼠皮膚的TEWL值和皮膚表面pH，作為表皮屏障功能恢復的評價指標；同時在各時間點收集小鼠耳組織和背根神經節，速凍后用于后續分析。

4. 細胞實驗：小鼠原代角質形成細胞的培養與檢測

分離成年對照組和RTX處理小鼠的耳皮膚，經dispase II和胰蛋白酶-EDTA消化后，獲得原代角質形成細胞，接種于膠原包被板，在KGM2培養基中培養，用于增殖和分化實驗；同時分離出生24小時內新生小鼠的皮膚制備原代角質形成細胞，用于神經肽篩選實驗。

增殖實驗：將角質形成細胞接種于96孔板，培養48小時后加入溴脫氧尿苷繼續培養24小時，通過ELISA試劑盒檢測溴脫氧尿苷的摻入量，評估細胞增殖能力。

分化實驗：將角質形成細胞用含1.3 mM CaCl?的高鈣培養基誘導分化，其中成年小鼠細胞分化3天，新生小鼠細胞分化5天；新生小鼠細胞分化的最后2天，在培養基中加入IL-6及不同神經肽（PACAP、甘丙肽、生長抑素、奧曲肽，濃度均為1mM），最終通過定量PCR檢測角質形成細胞分化標志物Flg的mRNA表達。

5. 分子水平檢測

定量RT-PCR分析：提取小鼠耳組織和背根神經節的總RNA，反轉錄為cDNA后，采用SYBR Green法進行定量PCR，檢測炎癥細胞因子、神經肽及受體、屏障相關基因的mRNA表達，以核糖體蛋白Rplp1為內參基因，通過2^(-ΔCt)法計算基因相對表達量。

細胞因子定量：將速凍的小鼠耳組織用含蛋白酶抑制劑的裂解液勻漿，經離心取上清，通過Bio-Plex平臺檢測IL-5、IL-6、IL-13的蛋白水平，并用Micro BCA試劑盒測定總蛋白含量對細胞因子水平進行歸一化。

6. 統計學分析：所有實驗數據以均值±標準差表示，使用Pharmaco Basic軟件進行統計分析；經F檢驗檢驗方差齊性后，采用Student t檢驗或Welch檢驗比較兩組差異；多組比較經Bartlett檢驗后，采用Dunnett檢驗或Steel檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

結論

1. TRPV1陽性感覺神經的消融會減緩小鼠膠帶剝離后的表皮屏障修復，表現為TEWL值和皮膚表面pH持續升高，同時伴隨皮下炎癥的持續存在，其中IL-6的表達上調，且角質形成細胞分化標志物Flg的mRNA表達降低；而Nav1.8-Cre R26-CAG-LoxP-EGFP-TeNT小鼠（C纖維和Aδ纖維感覺神經的胞吐被阻斷）也出現TEWL值持續升高，表明表皮屏障修復受損是由感覺神經元功能障礙導致。

2. 膠帶剝離后，對照組小鼠背根神經節中Adcyap1、Gal、Sst三種神經肽的mRNA表達上調，且高鈣培養基誘導分化的小鼠角質形成細胞中，PACAP受體Vipr1、甘丙肽受體Galr2、生長抑素受體Sstr2的表達也上調，提示這些神經肽可能參與表皮損傷后的皮膚屏障修復。

3. IL-6會導致小鼠角質形成細胞中Flg的mRNA表達下調，而生長抑素或其類似物奧曲肽可逆轉這一效應，PACAP和甘丙肽則無此作用；同時，奧曲肽可使RTX處理的去神經小鼠的TEWL值和皮膚表面pH得到部分改善，實現皮膚屏障修復的部分恢復。

4. 表達TRPV1的感覺神經元在表皮損傷后的皮膚屏障功能恢復中具有不可替代的作用，而由TRPV1陽性感覺神經釋放的神經肽生長抑素，可通過拮抗IL-6誘導的角質形成細胞分化下調，參與皮膚損傷后的表皮修復過程。